16-Article Text-108-1-10-20180113.pdf

Pages 10
Views 5
of 10
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Description
KEMAMPUAN WHOLE CELL HELICOBACTER PYLORI DALAM MENGINDUKSI DEGRADASI KOLAGEN TIPE IV MELALUI PENINGKATAN AKTIVITAS MAKROFAG Yuly Peristiowati Helicobacter pylori (H. pylori) an assosiation with acute myocardial infraction and cronic coronary disease. Bacteri cytotoxin can induce inflamatory of IL1-β and TNFα cytokine produce,and it can acitivated MMP-9 proteolotic enzyme, and it caused collogen degradation in plague atheroscler
Transcript
    KEMAMPUAN WHOLE CELL HELICOBACTER PYLORI   DALAM MENGINDUKSI DEGRADASI KOLAGEN TIPE IV MELALUI PENINGKATAN AKTIVITAS MAKROFAG  Yuly Peristiowati Helicobacter pylori (H. pylori) an assosiation with acute myocardial infraction and cronic coronary disease. Bacteri cytotoxin can induce inflamatory of IL1-  β   and TNFα   cytokine produce,and it can acitivated MMP-9 proteolotic enzyme, and it caused collogen degradation in plague atherosclerosis. This research aim to provit the whole cell H.pylori can induce the degradasi of collagen type IV by increase macrophage activity. It were seen from TNF  α   and IL1-  β  level use ELISA methode. Anova statistic analyse result show significan defferent (0,000) bettwen group control with macrophage induce whole cell H.pylori. Enzyme MMP-9 production detected with the gelatine zymography continued by western blotting with molecule weight 93 kDa. Collogen fragmentation result of molecule weight which fragment 61,2 kDa and 29 kDa. It concluded that whole cell H.Pylori can induce the degradation of collagen type IV, by increase macrophageag activity. So, the result of this research can support the patomekanism myocardial infract disease. Keyword : whole cell H.pylori, Macrophage, collagen Type IV LATAR BELAKANG Helicobacter p ylori (H.pylori) merupakan bakteri utama penyebab gastritis kronis pada manusia dan banyak dijumpai di seluruh dunia. H.pylori  juga dikaitkan dengan penyakit ,antara lain penyakit kardiovaskuler, khususnya strain yang lebih virulen.   Pada saat ini H. pylori merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit kardiovaskuler.Diyakini bahwa penyakit inflamasi mempunyai peran yang penting terhadap patogenesis penyakit kardiovaskuler (Amieva, 2002). Dari hasil pemeriksaan serologi penderita IMA terhadap infeksi mikroorganisme, diketahui bahwa 77,77 % disebabkan oleh infeksi H.pylori.  Cytotoxin dari bakteri tersebut dapat menginduksi produksi sitokin IL-1- β dan TNFα , yang selanjutnya mengaktivasi vaskuler endothelium (Romanelli, 1999).  Aterosklerosis merupakan salah satu penyakit inflamasi yang berhubungan dengan reaksi imun (Kalela, 2002). Pada lesi aterosklerotik, ditemukan makrofag dan limfosit dalam jumlah banyak, sel mast serta sel B. Pada proses inflamasi, sel-sel radang yang teraktivasi akan meningkatkan produksi proenzim, diantaranya Matrix Metalloprotease  atau MMPs. Proenzim ini dapat diubah menjadi enzim aktif yang menyebabkan lisisnya kolagen (Hansson, 2001).  Apabila proses ini terjadi pada permukaan plak aterosklerotik maka serabut kolagen yang melindungi plak akan mengalami lisis sehingga menjadi tipis dan akhirnya mudah ruptur. Kolagen tipe-IV merupakan komponen utama dari membran basal vaskular yang mudah rusak oleh aktivitas proteolitik enzim MMP. Outer membrane   H.Pylori berisi  phospholipids  dan lipopolysacharide  (LPS). Antigen O dari LPS mungkin fucosylated dan seperti kelompok antigen dalam darah pada endotelium gaster (Abbas, 2001). Pada outer membran H.Pylori   juga berisi cholesterol glucosides, dimana LPS    pada OMP H.Pylori   diduga juga merupakan endotoksin dapat menimbulkan efek sistemik pada host sehingga mempengaruhi fungsi lokal sel-sel dinding vaskular, menurunkan sistem resistensi vaskuler, mengaktifkan endotelium yang sehubungan dengan evolusi dan pembentukan ateroma yang pada akhirnya menyebabkan disrupsi plak. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan apakah whole cell H.pylori mampu menginduksi degradasi kolagen tipe IV melalui peningkatan aktivitas makrofag. METODE PENELITIAN Helicobacter pylori didapatkan dari laboratorium sentral Biomedik Rumah Sakit Umum Mataram kemudian dilakukan uji biokimia untuk mengidentifikasi H.pylori   meliputi Uji Pewarnaan Gram, Uji Urease, Uji Oksidase, Uji Katalase, Uji Gula-Gula Isolasi monosit dengan menggunakan metode Histopaque (Sigma - Leukocyte separation ). Monosit diisolasi dari buffy coat    Peripheral blood individu sehat sebanyak 50 ml. Sel mononukleus yang terdapat pada buffy coat   diperoleh menggunakan prosedur pemisahan dengan Ficol-Hypaque dan selanjutnya dicuci dengan medium RPMI yang mengandung HEPES 25 mM, 1,5 ml L-glutamin, 10 mg/ml gentamycine,fetal bovine serum 10%. Sel diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C , dengan tekanan CO 2  5%. Sel dicuci lagi sebanyak 2x dengan serum free. Sel dikultur diatas glass coverslip , pada plat-titermikro 24 sumuran dengan kepadatan 25x10 3 sel/sumuran. Kemudian ditambahkan medium komplet yang berisi FBS 10%, PMA 10 -7  (  pharbol 12-myristate 13-acetate ). Selanjutnya sel monosit diinkubasi selama 7 hari sampai berdeferensisi menjadi makrofag. H pylori dalam medium cair sebelum diinduksikan pada makrofag dihitung konsentrasinya dengan menggunakan Spektrofotometri. Untuk menentukan konsentrasi 10 8  sel/mL sampai mencapai OD 1. Bila OD 1 maka untuk menginduksikan bakteri dengan makrofag diperlukan 300 μ L H.pylori. Selanjutnya bakteri dalam medium dipipet dan diambil 2 mL dan dimasukkan kedalam falcon 15 mL. Kemudian sentrifuge 3000 rpm,RT 10 menit. Pelet diambil dan supernatan disisihkan. Kemudian pelet di cuci menggunakan RPMI atau PBS. Selanjutnya sentrifuge lagi 3500 rpm, RT 10 menit. Pelet diambil, dan supernatan dibuang. Pelet ditambahkan medium komplet (tanpa antibiotik). Bakteri siap diinduksikan pada makrofag. Peningkatan aktivitas makrofag yang diinduksi dengan whole cell    H.  pylori   yang dilihat dari peningkatan kadar TNF α  dan IL1- β  yang diperiksa menggunakan metode ELISA. Selanjutnya aktivitas makrofag dilihat dari produksi MMP-9 yang dihasilkan. Enzim MMPs diuji dengan menggunakan metode gelatin zymography  . Gel polyacrylamide 7,5% berisi gelatin 2 mg/ml substrat yang diduga berisi enzym berasal dari supernatan yang diinfeksi makrofag. Gel polyacrylamide running   dengan tris-glysine SDS running buffer  , dan running   pada kondisi voltase konstan (120 V), kuat arus (awal: 30  –  40 mA/gel dan akhir: 8  –  12 mA/gel) dalam 90 menit. Gel dilakukan renaturasi   pada Zymogram renaturing buffer   pada suhu ruang selama 30 menit sambil diagitasi. Gel dipindahkan ke Zymogram developing buffer   pada suhu ruang dengan agitasi lembut selama 30 menit kemudian gel dimasukan pada Zymogram developing buffer yang baru kemudian    diinkubasi pada 37°C semalam (24  jam). Gel dilakukan staining   dengan comassie brilliant blue R-250. . Untuk mendeteksi MMP-9 dilanjutkan dengan uji western blotting  . Enzim MMP-9 mempunyai berat molekul 93 kDa. Supernatan yang berasal dari makrofag yang diinduksi H. pylori   diyakini berisi komponen colagenolytic seperti MMP-9 yang selanjutkan direaksikan dengan kolagen tipe IV (sigma) 50 μ g/ml dengan perbandingan 1:1, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C dalam waterbath.  Sebelum direaksikan dengan supernatan kolagen tipe IV didialisa dulu selama 3 hari. Substrat kolagen tipe IV dilabel dengan biotin ( biotinylated collagen substrate ) kemudian didialisa selama 3 hari. Kolagen yang sudah berbiotin ditambahkan pada supernatan (MMPs dari whole cell H.pylori dan protein, kemudian diinkubasikan selama semalam dalam waterbath.  Supernatan yang sudah bercampur kolagen tipe IV dilihat profile degradasinya dengan menggunakan metode ligan blotting   dengan SDS - PAGE 12%. Hasil elektroforesis degradasi kolagen tipe IV dipindahkan ke membran NC menggunakan alat semi dry blotter   buatan Biorad. Membran NC direndam dalam 5% skim-milk selama 24 jam pada 4°C. Cuci dengan TBS-T 3x 5 menit, inkubasi SA-HRP 1 jam. Membran NC direndam dengan TMB substrat   selama 10  – 30 menit pada ruang gelap. Membran NC dibilas dengan akuades dan dikeringanginkan. Kemudian hasilnya di analisa. HASIL Helicobacter pylori   yang didapat dari Laboratorium Sentral Biomedik Rumah Sakit Umum Mataram. Dari hasil uji ulang secara biokimiawi H.pylori   dengan metode Microbact System 24E   yang dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya didapatkan : uji oksidase, motility, nitrat, glukose, manitol, xylose, ONPG, indole, urease, malonate, sorbitol, rhamnose, lactose, arabinose, arginin semuanya positif. Dari hasil uji biokimia tersebut dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri tersebut adalah Helicobacter pylori (Gambar 1) Gambar 1. Hasil Uji biIokimia H.pylori    Selanjutnya isolat bakteri dilihat dibawah mikroskop dengan pewarnaan gram didapatkan hasil : H.pylori berbentuk batang yang dapat dilihat pada gambar 1 Gambar 2 Bakteri H.pylori   gram negatif dengan pewarnaan gram (pembesaran >1000 kali) Sel berbentuk bulat, tepi rata, permukaan mengkilat, besarnya seragam (Gambar 3A). Untuk menginduksi diferensiasi monosit menjadi makrofag, pada medium ditambahkan PMA 10 -7 mM. Setelah 7 hari monosit dikultur , maka akan berubah menjadi makrofag yang ditunjukkan pada gambar 3B.   b    ompwholekontrol perlakuan 1200.001000.00800.00600.00400.00200.000.00     M   e   a   n    I    L    1  -    B   e    t   a Error bars: 95,00% CI Kadar IL-1 Betha A   B   Gambar 3. A ) Kultur monosit hari ke-1. Sel berbentuk bulat, tepi rata , permukaan mengkilat dan kompak, besar seragam B) Kultur monosit hari ke-7. monosit mengalami multiplikasi menjadi lebih banyak memenuhi dasar  flask  . Tanpa pewarnaan (pembesaran 400 kali) Kemampuan Aktivitas Makrofag dilihat dari peningkatan Produksi Sitokin TNF- α   dan IL- 1β   Gambar 4. Diagram Batang Hasil ELISA IL1- β  makrofag yang dipapar dengan Whole dan OMP H.pylori Dari tabel diatas dapat dilihat ada perbedaan yang bermakna kadar IL1- β  pada ketiga perlakuan. Secara statistik (ANOVA satu arah, α =0.05), produksi IL1- β  pada ketiga perlakuan terdapat perbedaan secara bermakna antara perlakuan dengan Whole cell H.pylori , dan kelompok kontrol dengan tingkat kemaknaan 0,000. Kemudian dilanjutkan dengan uji post hoc antara kontrol dengan whole nilai signifikannya 0,000. Gambar 5 Diagram Batang Hasil ELISA TNF- α  makrofag yang dipapar dengan Whole dan OMP H.pylori    Dari tabel diatas dapat dilihat terjadinya peningkatan kadar TNF α  tertinggi pada induksi Whole cell H.pylori.  Secara statistik (ANOVA satu arah, α=0.05), produksi TNFα  pada ketiga kelompok terdapat terdapat perbedaan secara bermakna antara kelompok perlakuan dengan Whole cell H.pylori dan kelompok kontrol dengan tingkat kemaknaan 0,000. Kemudian dilanjutkan dengan uji  post hoc   didapatkan antara kontrol dengan whole cell   nilai signifikannya 0,000, Berarti ada perbedaan yang bermakna. Deteksi aktivitas MMP-9. Hasil gelatine zymography   menunjukkan bahwa makrofag yang dipapar dengan whole cell H.pylori dan protein 62 kDa pada outer membrane   H.pylori memberikan gambaran jumlah produksi enzim dengan berat molekul yang sama (Gambar 6) Pada gambar 6 diatas menunjukkan pada sumur 3-6 merupakan supernatan dari makrofag yang diinduksi Whole   cell    H.pylori terdapat pita berwarna putih tebal dengan berat molekul 93 kDa dan 62 kDa. Sedangkan pada sumur 1 yang merupakan medium dari makrofag yang tidak diinduksi bakteri tidak terlihat adanya gambaran pita putih. Hal ini menunjukkan bahwa aktifitas MMPs hanya terdapat pada supernatan dari makrofag yang diinduksi oleh whole cell    H.pylori  . ompwholekontrol perlakuan 4000.003000.002000.001000.000.00     M   e   a   n    T    N    F  -   a    l    f   a Error bars: 95,00% CI Kadar TNF Alpha
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks
SAVE OUR EARTH

We need your sign to support Project to invent "SMART AND CONTROLLABLE REFLECTIVE BALLOONS" to cover the Sun and Save Our Earth.

More details...

Sign Now!

We are very appreciated for your Prompt Action!

x